TRITC标记葡聚糖 TRITC-dextran
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TRITC标记葡聚糖

来源:作者:人气:-发表时间:2020-07-16 15:40:00【
TdB葡聚糖衍生物
TRITC标记葡聚糖
化学名称: Dextran (3´6´tetramethylamino dihydroxy-3oxospiro(isobenzofuran-1(3H),(9H) xanthen)-5(or 6)-yl)carbamothioate
TRITC标记葡聚糖是由特定分子量的葡聚糖和四甲基罗丹明B异硫氰酸酯(异构混合物)结合而成,方法如de Belder和Granath(1)所述。TRITC标记葡聚糖的荧光强度随pH变化较FITC标记葡聚糖要小得多。
检测所有批次的分子量,取代度,干燥失重和游离TRITC。TdB提供分子量4 kDa到2000 kDa的TRITC标记葡聚糖。TRITC标记葡聚糖为粉色粉末。
结构与性质
葡聚糖是来源于肠系膜白串珠菌的带支链多糖,本质上是一种α-(1-6)链接的线性葡萄糖链。支链比例大约是5%。
特定分子量的TRITC标记葡聚糖是由天然的葡聚糖B512F通过四甲基罗丹明B标记合成,方法如de Belder和Granath(1)所述。罗丹明部分是通过稳定的硫氨甲酰键链接,且标记过程不会导致葡聚糖解聚。TRITC标记葡聚糖含0.001到0.008 mol TRITC每个葡萄糖单元,低取代度使葡聚糖电荷极小,这也是渗透性研究最基本的要求。
TRITC标记葡聚糖是红色粉末,可溶于水和盐溶液形成红色溶液。该产品也可溶于二甲亚砜、甲酰胺和特定极性有机溶剂,但是不溶于低分子量脂肪醇,丙酮,氯仿和二甲基甲酰胺。
图 1 TRITC标记葡聚糖分子结构示意图
图 1 TRITC标记葡聚糖分子结构示意图
光谱数据
最佳激发波长为550nm,荧光检测在572 nm (参 图2)。TdB实验室的研究表明TRITC标记葡聚糖溶液的荧光在pH3-9范围内随pH降低仅略微增强 (参见图3)。类似结果早前也见诸报道(2)。在进行定量检测时这一点十分有意义。 生物介质测量会显著影响荧光强度,或者增强,或者衰减。
图 2 pH9.0时 TRITC标记葡聚糖 40 在0.025M 硼酸盐溶液 (9.9 mg溶于50 ml缓冲液)的荧光图谱
图2. TRITC标记葡聚糖在pH为9.0的0.025M的硼酸盐缓冲液中(12mg溶于50毫升缓冲液)的荧光吸收图谱,
激发波长552nm,发射波长576nm。
图 3 pH4-9范围内TRITC标记葡聚糖的荧光与pH的依赖性
图 3 pH4-9范围内TRITC标记葡聚糖的荧光与pH的依赖性
物理化学性质
分子量超过5000Da的葡聚糖在溶液中呈有弹性的线圈状。表1(下表)显示了不同分子量下的分子尺寸。
表 1. 以斯托克半径 (Å)表征的葡聚糖分子尺寸
表 1。 以斯托克半径 (Å)表征的葡聚糖分子尺寸
葡聚糖和TRITC标记葡聚糖表现出牛顿流动特性,例如粘度与剪切速率无关。研究表明在pH 4-10范围内粘度与pH无关。不同浓度的葡聚糖组分的粘度如图4所示。
图4. 不同葡聚糖组分粘度与浓度不相关
图4. 不同葡聚糖组分粘度与浓度不相关
储存和稳定性
TRITC标记葡聚糖的稳定性尚未进行过详细研究,但推测与FITC标记葡聚糖相似(见数据文件)。仅在pH值升高(<9)和温度升高时,才有硫氨甲酰键水解的风险。更多详细信息,请参阅FITC标记葡聚糖的数据。
室温下储存在干燥密闭的容器中,TRITC标记葡聚糖可稳定保存6年。
毒性
毒性模式与母体葡聚糖相似。临床上,葡聚糖作为血浆增溶剂使用已经超过50年。人体临床上注射葡聚糖溶液后后,观察到葡聚糖诱导的类过敏反应(DIARs)(3, 4)。反应症状从轻微的皮肤反应到严重的休克状态。严重反应的发生率约为每2000人1例。TRITC标记葡聚糖也可能出现这种情况,但少有实验动物出现问题的报告。
应用
TRITC标记葡聚糖主要用于研究细胞和组织的渗透性和传导转运(5)。额外的好处是通过测量荧光可提供相关健康和病变组织传导和渗透性的定量数据。该项研究可以通过活体体内荧光显微镜实时进行。该技术灵敏度高,可在组织液中检测到低至1µg/ml的浓度。与FITC葡聚糖不同,TRITC标记葡聚糖的荧光对于pH4-9范围内的pH变化不敏感。另一个重要特性是TRITC标记葡聚糖不与动脉壁结合(6,7)。
常规过程
仓鼠颊囊的微血管构筑已被证明是一个研究血浆渗漏有用的模型,例如缺血/再灌注后,暴露于炎症介质(8-10)。利用这项技术,可以实时研究血管渗透性,并与其他微血管事件相关联,例如白细胞粘附和活化。使用合适的滤光片,通过活体荧光显微镜检查面颊囊,并用数码相机拍摄图像(见图5)。例如使用5%TRITC标记葡聚糖150溶液(约100mg/公斤体重)。
图5 组胺激发试验15分钟后将TRITC标记葡聚糖 150注射入仓鼠颊囊 (感谢E. Svensjö 授权使用)
图5 组胺激发试验15分钟后将TRITC标记葡聚糖 150注射入仓鼠颊囊 (感谢E. Svensjö 授权使用)
另一种使用兔耳腔的替代方法已发表。用再生钛耳腔(家兔)和荧光标记葡聚糖,研究血液/淋巴系统的微循环。移植后4-8周可见淋巴生长(11)。
Thorball(5)报道了利用组合荧光立体显微镜进行的渗透性研究。大量FITC标记葡聚糖参与的组织固定技术研究已经发表,同时也与TRITC标记葡聚糖研究对应。显微镜设置(滤光片,照明)的细节可以在本文中找到。Mullick和他的同事描述了一种使用TRITC标记葡聚糖4对内皮层通透性进行序列定量的新方法。灌流液中TD4含量为42μg/ml(12)。
细胞渗透性研究
研究了FITC和TRITC标记葡聚糖在小鼠巨噬细胞溶菌体中的亚细胞荧光。比较这些值可以估计细胞内pH值。培养物在1 mg/ml葡聚糖浓度下培养(13)。
其他研究使用荧光探针描述了活细胞中的质子积累(14)。肠细胞407对TRITC标记葡聚糖10的吸收反应已有报道(15)。TRITC标记葡聚糖10(5mg/ml)也被用作流动相标记物(16)。TRITC标记葡聚糖4用于具屏障功能的前列腺癌细胞培养(17)。
Mairhofer和同事用TRITC标记葡聚糖4研究了SLP-1在核周体中的晚期内质定位(18)。在跨细胞蛋白质传递的研究中,使用TRITC标记葡聚糖10(0.1mg/ml)来检测反式-激活剂融合的内化作用的动力学(19)。
动脉和微血管系统的渗透性研究
TRITC标记葡聚糖4和70用于研究叶酸缺乏症大鼠颈动脉的通透性,注射浓度为42μg/ml(21)。TRITC标记葡聚糖在某些潜在治疗中被证明有用(22-24)。
产品列表
产品编号
品名
分子量(kDa)
包装
TRITC-dextran 4
4
100 mg
1 g
TRITC-dextran 20
20
100 mg
1 g
TRITC-dextran 40
40
100 mg
1 g
TRITC-dextran 70
70
100 mg
1 g
TRITC-dextran 150
150
100 mg
1 g
TRITC-dextran 500
500
100 mg
1 g
TRICT-dextran 2000
2000
100 mg
1 g
参考文献
1. A.N.de Belder and K.Granath. Preparation and properties of fluorescein labelled dextrans. Carbohydr Res.1973;30:375-378.
2. MJ.Geisow, Fluorescein conjugates as indicators of sub cellular pH. A critical evaluation, Exp Cell Res.1984 Jan;150(1):29-35.
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