FITC标记聚蔗糖(FITC-Polysucrose)
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FITC标记聚蔗糖

来源:作者:人气:-发表时间:2020-06-28 16:20:00【
TdB葡聚糖衍生物
FITC标记聚蔗糖
化学名称: Polysucrose (3’,6’dihydroxy3-oxospiro (isobenzofuran1(3H) ,9’[9H] xanthen]-5(or 6)-yl) carbamothioate
Fluorescein isothiocyanate Fluoresceinyl thiocarbamoyl Polysucrose
聚蔗糖是一种具有良好生物相容性的聚合物,比葡聚糖对酸更敏感,因此在酸性条件下须小心操作。TdB生产FITC标记聚蔗糖,从20kDa到400kDa,检查所有批次的分子量、取代度、干燥失重和游离FITC以保证质量。FITC标记聚蔗糖为黄色粉末。
结构
聚蔗糖是由蔗糖与环氧氯丙烷交联合成的聚合物。FITC标记聚蔗糖,在与合成FITC标记葡聚糖相似的条件下,让聚蔗糖与FITC反应制备而成。聚蔗糖具有更大的球形结构,与葡聚糖相比弹性较小
FITC标记聚蔗糖是黄色粉末,极易溶于水和盐溶液,形成黄色的溶液。本品也可以溶于DMSO ,甲酰胺和一些极性有机溶剂中,但在低链脂肪醇、丙酮、氯仿,二甲基甲酰胺中溶解度较低。聚蔗糖是由蔗糖和环氧氯丙烷聚合而成。该聚合物高度分叉,在溶液中性能接近球形分子(参见物理化学性质章节)。聚蔗糖仅包含伯羟基和仲羟基基团。
图1 FITC标记聚蔗糖分子结构示意图
图1 FITC标记聚蔗糖分子结构示意图
光谱数据
FITC标记聚蔗糖在pH 9下的最大激发波长是493nm,最大发射波长为523nm。FITC标记聚蔗糖溶液在pH 3-9范围内的荧光与pH相关。 在生物介质中的测量可能会显著地影响荧光强度,荧光强度因此得到增强或削弱。
合成
按照de Belder和Granath所述(1)类似方法,通过荧光素标记聚蔗糖片段。荧光素部分通过稳定的硫代氨甲酰键连接,并且标记过程不会致聚蔗糖解聚。FITC标记聚蔗糖中,每单位葡萄糖含有0.001-0.008 摩尔 FITC。低取代度下,电荷的影响很小,这也符合渗透性研究的基本要求。
物理化学性质
据结构推测,聚蔗糖分子在溶液中表现类似球状分子。 表1 (下方)葡聚糖和聚蔗糖组分的Stokes半径的比较,反映出其分子弹性的差异。该分子被认为是介于坚固的球体和弹性的线圈之间的中间形态。因此,当比较具有哦相近分子量的聚蔗糖和葡聚糖时,聚蔗糖的分子尺寸常常更小一些。在使用GPC检测聚蔗糖产品的分子量时,使用葡聚糖参照品是不合适的。相较于同等浓度的蔗糖溶液,聚蔗糖溶液有非常低的渗透压。 10%的聚蔗糖70溶液的渗透压为3 mOs/kg,而同样10%的蔗糖溶液渗透压为 150 mOs/kg。
MW *103
葡聚糖Stokes半径
聚蔗糖Stokes半径
白蛋白Stokes半径
500
147
106
-
70
58
49.5
35
49
44.5
40
-
表1. 以Stokes半径表示的聚蔗糖和葡聚糖的分子尺寸
储存和稳定性
FITC标记聚蔗糖粉末在密闭容器中储存在室温下,在溶液中至少可以稳定6年。虽然FITC标记聚蔗糖的稳定性尚未详细研究,荧光素和聚蔗糖之间的硫代氨甲酰键的稳定性类似于葡聚糖(关于FITC葡聚糖的稳定性信息,请参见相关数据文件)。只有在较高的pH(>9)和温度下,硫氨酰键才有水解的风险。
FITC葡聚糖在pH4温度35℃时可稳定1个月,但由于蔗糖糖苷键的不稳定性,不推荐用于聚蔗糖基产品的保存。聚蔗糖本身可以在中性和微碱性的pH下加压解聚。
毒性
聚蔗糖组分经口或静脉测试无中毒症状。在实验动物静脉注射聚蔗糖(分子量100000到500000),剂量高达12g/kg时,亦未出现中毒症状。不过,聚蔗糖不会在血液中降解,并在肝脏、脾脏和肾脏中堆积。聚蔗糖与细胞、病毒或微生物具有良好的生物相容性,在分离技术中已应用数十年。
应用
FITC标记聚蔗糖主要用于研究渗透性和微循环。由于其球形结构,常被用于肾小球过滤研究。
生物学方面及其应用
聚蔗糖及其衍生物,为研究多种器官的生理学研究提供了多种有趣的特性。近年来许多关于肾小球膜的文章面世。与葡聚糖不同的是,聚蔗糖具有更致密的球状结构,似乎具有一定的韧性,最好视其为介于硬球状蛋白和松散的葡聚糖弹性线圈之间的中间结构。聚蔗糖具有良好的生物相容性,不为肾小管分泌或再吸收。
研究了葡聚糖和聚蔗糖窄分布样品在膜中扩散系数(2)。结果表明,聚蔗糖的扩散性能与线性聚合物有显著差异,线性聚合物在膜中扩散速度较快。作者的结论是,聚蔗糖的表现更类似一个固体球。使用GPC结合光散射和粘度检测器对聚蔗糖分子的尺寸和构象进行了仔细的研究,结果表明聚蔗糖分子最好被理解为介于固体球和溶解性良好的线性不规则线圈之间的中间结构(3)。Venturoli和Rippe(4)回顾了聚蔗糖和葡聚糖在肾小球渗透选择性的数据,并与肾小球蛋白进行了对照。作者阐述了影响结果的各种性质,如分子大小、形状、电荷和柔韧性,并用不同的孔隙模型对其结果进行了评价。
FITC标记聚蔗糖主要用于研究渗透性和细胞、血管和组织中的传输。附加的好处是测量荧光度,可提供健康和病变组织传输和渗透性的定量数据。这些研究可通过活体荧光显微镜实时进行。该技术具有高灵敏度,在组织液中可检测到低至1微克/毫升的浓度。
通用程序
仓鼠颊囊微血管研究,已证明是一个有用的模型,用于研究不同实验条件下的血浆渗漏,例如缺血/再灌注后,一系列炎症介质、寄生虫和细菌的局部应用。利用该技术可以实时研究血管渗透性的变化,与白细胞粘附和活化等微血管事件相关。使用合适的滤光片(490/520nm)对颊囊进行活体荧光显微镜检查,并用数码相机拍摄图像。实验动物推注FITC标记聚蔗糖的适宜浓度为5%(约100mg/kg体重)(5-7)。本文介绍了一种使用兔耳腔的替代方案。用可再生的钛耳腔(兔)为材料,用荧光标记葡聚糖研究血液/淋巴系统的微循环。植入4-8周后可见淋巴生长(8)。
多分散性
多糖是测量肾小球渗透选择性的优良探针,结果可复制,可靠和简明。作者详细阐述了 影响分子大小、形状、电荷和柔韧性等结果,并在各种孔隙模型中评估其结果。
静脉注射聚蔗糖,肾小球通透性的研究表明,在50Å 左右有一个极限值,而葡聚糖极限值则在60-70°之间,这是由于葡聚糖具有更大的灵活性。为了阐明大分子的传输途径,我们研究了FITC在缺失内皮细胞的裸小鼠体内的代谢情况。使用FITC标记聚蔗糖70和400(即FITC标记菊粉)在不同渗透率下研究肾小球渗透性。(15)
对葡聚糖和聚蔗糖的肾小球渗透性研究表明,肾小球膜对聚蔗糖的屏障比对葡聚糖的屏障更为严格(16)。
有趣的是,聚蔗糖的筛分系数θ值与不带电的球状蛋白的报导值接近。应用FITC-70/400(17)监测大鼠手术后肾小球筛分和肌肉损伤。采用FITC标记聚蔗糖400(960微克)、FITC标记聚蔗糖70(40微克)和FITC inulin(500微克)的混合物搓成小团喂食大鼠。采用FITC标记聚蔗糖70/400检测caveolin-1基因敲除小鼠肾小球的筛分,探讨影响肾小球渗透性的因素(18)。
FITC标记聚蔗糖70和白蛋白用于在使用酶降解糖萼中各种多聚糖胺治疗前后,评估小鼠的清除率(19)。给大鼠注入FITC标记聚蔗糖70和白蛋白,探讨温度和氯化铵浓度对大鼠清除率的影响。温度在8~37℃范围时,筛分系数差异并不显著。聚蔗糖的作用与葡聚糖不同,θ在20-70Å范围内低于相应的葡聚糖。溶质形状的影响可能超过颗粒尺寸和电荷(20,21)。
为进一步解释蛋白质穿过毛细血管壁的传导,使用包括FITC标记聚蔗糖(22)在内的多种渗透性探针,以内皮细胞质膜微囊缺乏小鼠为对象进行了研究。测定灌注低离子强度的FITC标记聚蔗糖的孤立肾的清除率(23)。含约70mg /L的FITC标记聚蔗糖70灌流液用来评估灌注9周后糖尿病患天然白蛋白清除率的增加,是由于电荷选择性降低还是由于大孔比例的改变引起的(24)。
最近的研究探索了一氧化氮(25)、活性氧(26)和清除剂对肾小球通透性的影响(27)。
产品列表
产品编号
品名
分子量(kDa)
包装
FITC-Polysucrose 20
20
100 mg
1 g
FITC-Polysucrose 20
40
100 mg
1 g
FITC-Polysucrose 50
50
100 mg
1 g
FITC-Polysucrose 70
70
100 mg
1 g
FITC-Polysucrose 100
100
100 mg
1 g
FITC-Polysucrose 170
170
100 mg
1 g
FITC-Polysucrose 400
400
100 mg
1 g
参考文献
1. A.N.de Belder and K.Granath. Preparation and properties of fluorescein-labelled dextrans. Carbohydr Res.1973;30:375-378.
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