FITC标记菊粉 FITC-inulin
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FITC标记菊粉

来源:作者:人气:-发表时间:2020-06-18 13:56:00【
TdB葡聚糖衍生物
FITC标记菊粉
化学名称: Inulin(3’,6’dihydroxy-3-oxospiro(isobenzofuran-1(3H) ,9’-[9H] xanthen]-5 (or 6)yl) carbamothioate
Fluorescein isothiocyanate- Inulin
Fluoresceinyl thiocarbamoyl- Inulin
菊糖是一种低分子量的聚果糖,人和动物肠道外给药时具有良好的耐受性。它被肾小球完全过滤,不被肾小管分泌或再吸收,因此被认为是测量肾小球滤过率(GFR)的金标准。
不同来源的菊糖纯化组分,分子量约为3000至5000。
结构
FITC标记菊粉是由异硫氰酸荧光素(FITC)与来源于大丽花块茎的菊粉合成而成,方法如de Belder和Granath(1)所述。产品为黄色粉末,易溶于水或盐溶液,形成黄色的溶液。稀溶液(1-2%)透明澄清,而浓溶液在静置后会析出菊粉的结晶,结晶在加热条件下可以重新溶解。温度升至80°C,保持溶液近中性。该品也可溶于DMSO, 甲酰胺和其它极性有机溶剂,但不溶于短链脂肪醇,丙酮,氯仿,二甲基甲酰胺。
所有批次的分子量、取代度、干燥失重和游离FITC都要检查。TdB提供分子量为4kDa的FITC标记菊粉。
荧光素部分通过稳定的硫代氨甲酰键连接,并且标记过程不会致菊糖解聚。FITC标记菊粉中,每单位果糖含有0.001-0.008 摩尔 FITC。低取代度下,电荷的影响很小。
FITC标记菊粉分子结构示意图
图1 FITC标记菊粉分子结构示意图
光谱数据
FITC标记菊粉的最大激发波长490 nm,最大发射波长 520nm(见 Fig.2)。荧光强度与pH相关。pH3-9时,FITC标记菊粉溶液的荧光相关性见图3.。 在生物介质中的测量可能会显著地影响荧光强度,荧光强度因此得到增强或削弱。
FITC标记菊粉的荧光吸收图谱
Fig. 2 pH9.0的0.025M硼酸缓冲液(13.5 mg溶于50ml缓冲液)中FITC标记菊粉的荧光吸收图谱。最大激发波长490 nm,最大发射波长 520nm。
FITC标记菊粉的荧光相关性
图3 FITC标记菊粉的荧光相关性
物理化学性质
FITC标记菊粉的平均重均分子量是由SEC检测确定的(Superose 6+ 12; 葡聚糖标准品校准),大约是5000。三个批次的检测结果分别为:5440, 5165, 5640。 使用Dionex树脂分离得到菊粉,甚至可获得分散度高至30的组分。缺点是该方法并不定量(2)。Phelps 使用检测渗透压来确定重均分子量,数值是5640 (3) 。
当使用光散射法时,得到的重均分子量的数据是7250。值得注意的是,低分子量下,光散射法得到的数据不那么可靠。
Marchessault和同事研究了菊糖晶体的结构,他们提出了五倍螺旋结构(4)。后来André和同事利用电子衍射技术对菊糖单晶进行了研究,发现了两个反向平行的六重螺旋结构(5)。
储存和稳定性
FITC标记菊粉在密封容器室温下可以保存6年以上。
室温下密封保存,FITC标记菊粉可以稳定超过6年。稳定性与FITC标记葡聚糖类似。
只有在较高的pH(>9)和温度下,硫氨酰键才有水解的危险。和聚蔗糖一样,由于呋喃果糖单元对酸水解的敏感性,其在酸性pH下的稳定性较差。
毒性
菊粉经口或静脉测试无中毒症状。
应用
菊粉长期以来一直用于监测肾清除率。 FITC标记菊粉提供了一种简便灵敏的实时分析方法,以替代繁琐的化学分析。
生物学方面及其应用
FITC菊粉主要用于研究实验动物肾小球滤过率(GFR),也用于研究影响其它组织透过性的因素。
荧光测量分别提供了健康和疾病组织的传输和渗透性的定量数据。此类研究可以通过活体荧光显微镜实时进行。该技术具有高灵敏度,在组织液中可检测到低至1微克/毫升的浓度。
肾小球膜透过性的研究
在大鼠股静脉注射FITC菊粉后,测定大鼠肾小管液与血浆浓度的比值(6)。通过比较51Cr-EDTA和[H3]-菊糖,确定了该方法作为肾小球滤过率测量的有效性。Fleck在1999年(7)对FITC菊粉用于GFR研究进行了全面的调查。大鼠经尾静脉或颈静脉以每小时4ml/100g体重的速率给药4mg/mL。
Dunn和同事发现小鼠肌酐清除率(通过两种方法)和FITC菊粉清除率(8)之间存在良好的相关性。用FITC菊粉测定小鼠GFR的两种方法已见诸报道(9)。
Lorenz和Gruenstein描述了一种简单、非放射性方法,使用FITC菊粉(10)评估单个肾小球滤过率。FITC标记菊粉用于测定小鼠肾小管的液体吸收(11)。用FITC菊粉(12)研究了雄性和雌性经饮食诱导的2型糖尿病小鼠的肾功能和葡萄糖输送。用FITC菊粉灌流法研究了单个近端小管和负鼠肾细胞(KO)。在(14-15)中,有很多KO细胞研究中,FITC菊粉作为液相内标和FITC标记白蛋白作为受体介导的内标。测定了肾上皮细胞Ca+开关前后FITC标记菊粉的输送率变化(16)。最近,FITC标记菊粉用于评估生物人工肾装置的屏障功能(17,18)。
其他细胞透过性研究
FITC菊粉对肠上皮细胞单层透过性的研究(19)已见诸报道。Neunlist和同事使用FITC标记菊粉和FITC标记葡聚糖研究肠上皮细胞单层的透过性(20)。照射后2~24小时,用FITC标记菊粉(21)通过免疫荧光显微镜观察结肠上皮紧密连接(TJ)、贴壁连接(AJ)和肌动蛋白细胞骨架的完整性。FITC标记菊粉在肝脏和肠道组织破坏的研究中也很有价值(22)。
葡聚糖和FITC标记葡聚糖具有牛顿流体特征,例如粘度与剪切速率无关(图4)。在pH4-10范围的研究显示,粘度与pH无关。 在pH8-9和6.5-9.5下,经电泳,FITC标记菊粉的等电点未发生迁移(1)。
产品列表
产品编号
品名
分子量(kDa)
包装
FITC标记菊粉
4500
100 mg
1 g
5 g
参考文献
1. A.N.de Belder and K.Granath. Preparation and properties of fluorescein-labelled dextrans. Carbohydr Res.1973;30:375-378.
2. C.Fleck. Determination of the glomerular filtration rate (GFR); Methodological problems, age-dependen- ce, consequences of various surgical interventions, and the influence of different drugs and toxic sub- stances. Physiol Res.1999; 48:267-279.
3. C.F.Phelps. The physical properties of inulin solu- tions. Biochem J. 1965;95:41-47.
4. R.H.Marchessault, T.Bleha, Y.Deslandes et al. Con- formation and crystalline structure of (2-1)-α-D-fructofuranan(inulin). Can J Chem. 1980;58:2415-2421.
5. I.André, K.Mazeau, I.Tvaroska et al. Molecular and crystal structures of inulin from electron diffractional data. Macromolecules. 1996;29:4626-4635.
6. M.Sohtell, B.Karlmark and H.Ulfendahl. FITC-in- ulin as a kidney tubule marker. Acta Physiol Scand. 1983;119:313-6.
7. C.Fleck, Determination of the glomerular filtration rate(GFR); Methological problems, Age-dependence, consequence of various surgical interventions and the influence of different drugs and toxic substances. Physiol Res.1999;48:267-279.
8. S.R.Dunn, Z.Qi, E.P.Bottinger et al., Utility of endo- genous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 2004;65:1959-67.
9. Z.Qi, I.Whitt, A.Mehta et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;286:F590-6.
10. J.N.Lorenz and E.Gruenstein. A simple, non radio- active method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 1999;276:F172-7.
11. J.Ba, D.Brown and Friedman. Calcium- sensing receptor regulation of PTH-inhibitable proximal tubule phosphate transport. Am J Physiol Renal Physiol. 2003;285: F1233-43.
12. W.T.Noonan and R.O.Banks. Renal function and glucose transport in male and female mice with diet induced type II diabetes mellitus. Proc Soc Exp Biol Med. 2000; 225: 221-30.
13. J.S.Schwegler, B.Heppelmann, S.Mildenberger et al. Receptor-mediated endocytosis of albumin in cultured opossum kidney cells: a model for a prox- imal tubular protein reabsorption. Pfluegers Arch. 1991;418:383-92
14. M.Takano, N.Nakaanishi, Y.Kitahara et al. Cispla- tin-induced inhibition of receptor-mediated endocyto- sis protein in the kidney. Kidney int. 2002;62:1707-17.
15. Y.Sasaki, J.Nagai, Y.Kitahara et al. Expression of chloride channel, C1C-5, and its role in receptor mediated endocytosis of albumin in OK cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;282:212-8.
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